【关键词】 反相高效液相色谱法,二极管阵列检测器,葛根芩连配方颗
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摘要 采用反相高效液相色谱法二极管阵列检测器，以甲醇水(内含1%三乙胺、1%乙酸，用磷酸调pH至3)为流动相，对中药复方制剂葛根芩连配方颗粒中3种主要标志性成分的含量同时分析测定，并采用相同的流动相对其指纹图谱进行研究。实验结果显示，3种主要标志性成分葛根素、黄芩苷和小檗碱在含量分析测定条件下，各组分分离良好，相关系数均为0.9999，线性范围分别为0.042~1.05、0.13~3.25和0.060~150 μg，加样回收率在95％～106%之间；在指纹图谱研究中，以黄芩苷为参照物峰，标定了32个共有峰，分析的11批葛根芩连配方颗粒与共有模式之间具有良好的相似性，相似度均在0.9以上。建立的含量测定及指纹图谱分析方法灵敏度高、专属性强，可用于葛根芩连配方颗粒的质量控制。
关键词 反相高效液相色谱法，二极管阵列检测器，葛根芩连配方颗粒，指纹图谱
1 引言
葛根芩连汤原载于东汉张仲景《伤寒论》中，是经典古方之一，其处方为：葛根半斤、甘草二两（炙）、黄芩三两、黄连三两。方中葛根为君药，黄芩、黄连为臣药，炙甘草为使药。葛根、黄芩和黄连中主要标志性成分分别为葛根素、黄芩苷和小檗碱。据报道[1,2]，葛根具有解热、解痉作用；黄连、黄芩对伤寒杆菌、痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌均有抑制作用，黄连还有止泻、镇痉作用。为了保证葛根芩连配方颗粒质量，有必要对以上3个标志性成分进行含量分析及指纹图谱研究。目前葛根芩连制剂分析方法多采用不同的流动相分别测定主要成分葛根素、黄芩苷和小檗碱含量[3~5]，葛根芩连配方颗粒中3种主要标志性成分同时测定尚未见文献报道。中药复方制剂成分复杂，成分间相互干扰大，且主要标志性成分类别不同，葛根素为异黄酮C糖苷类，黄芩苷为黄酮糖醛酸苷类，小檗碱为原小檗碱类。本实验采用高效液相色谱法，同时测定葛根芩连配方颗粒中主要标志性成分葛根素、黄芩苷和小檗碱的含量，并对其指纹图谱进行研究，标定了32个共有峰。分析方法省时简便，为葛根芩连制剂的质量控制及进一步深入研究提供了方便。
2 实验部分
2.1 仪器和试药
1100高效液相色谱仪，包括G1315B紫外可见光二极管阵列检测器（美国安捷伦公司）；Delta320S pH计（METTLER TOLEDO）。
葛根素、黄芩苷和小檗碱对照品由中国药品生物制品检定所提供；葛根芩连配方颗粒由江阴天江药业有限公司提供。甲醇为色谱纯，水为去离子水，其余试剂均为分析纯。
2.2 葛根芩连配方颗粒高效液相色谱条件
色谱柱：Phenomenex Lura 反相C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm i.d.)；流动相：A相为水(含1%三乙胺、1%乙酸，用磷酸调pH至3)；B相为甲醇，流速：1.0 mL/ min；柱温：30℃；进样量：20 μL。
2.3 样品制备
2.3.1 混合对照品溶液的配制 精确称取葛根素、黄芩苷和小檗碱对照品适量，用甲醇定容至100 mL，得到含葛根素、黄芩苷和小檗碱的混合对照品储备液，冰箱中避光保存；临用前用甲醇将混合对照品储备液逐级稀释得6个浓度水平的混合对照品工作溶液，供作标准曲线。
2.3.2 供试液制备 精确称取0.24 g葛根芩连配方颗粒，置于50 mL量瓶中，加适量甲醇，超声提取30 min共2次，用甲醇定容至50 mL。精密吸取2 mL于10 mL量瓶中用水定容，样品溶液经0.45 μm微孔滤膜过滤后待用。
3 结果与讨论
3.1 葛根芩连配方颗粒含量分析
3.1.1 色谱条件优化 根据药典[6]及葛根芩连配方颗粒全波长扫描图可知，葛根素、黄芩苷最大吸收波长分别为250 nm、280 nm；小檗碱的最大吸收波长265 nm和346 nm。实验发现小檗碱采用346 nm时干扰较小，最终确定检测器波长为250 nm、280 nm和346 nm。实验时查阅参考文献[7,8]等考察了很多流动相，分离效果均不理想，最后采用甲醇水(内含1%三乙胺、1%乙酸，用磷酸调pH至3)为流动相，线性梯度洗脱时间程序甲醇为27％～41%时，葛根素、黄芩苷和小檗碱3个主要标志性成分的分离度(R)分别为2.3、3.7、2.0，拖尾因子(T)分别为1.04、1.09、1.09，理论塔板数(N) 5000以上，完全分离、峰形较理想。图1为270 nm波长下葛根素、黄芩苷和小檗碱的对照品色谱图１a和葛根芩连配方颗粒样品的色谱图１b。
图1 混合对照品(a) 和葛根芩连配方颗粒样品(b) 的色谱图（略）
Fig.1 Chromatograms of mixed standard solution (a) and Gegen Qinlian despensing granules (b)
1. 葛根素(puerarin); 2. 小檗碱(berberine); 3. 黄芩苷(baicalin)。
3.1.2 标准曲线 在2.2所述色谱条件下，检测波长：250、346和280 nm。线性梯度洗脱时间程序：开始14 min B相27%,在１5~40 min为32．6%，41~5１ min为41%, 52 min为65%，保持10 min。各混合对照品工作溶液分别在6个浓度点，平行测定3 次。以对照品进样质量C(μg) 对色谱峰面积A进行线性回归。根据本实验结果，对于待定量的3种物质，在最优化实验条件下，峰面积值与样品质量呈线性关系，回归方程、线性范围、相关系数及检出限结果见表1。结果表明各成分在各自浓度范围内线性关系良好。
表1 各成分标准曲线和检出限（略）
Table 1 Regression equation and detection limit for different compounds
3.1.3 提取方法的选择 本研究分别考察了3种提取方法对葛根芩连配方颗粒提取效率的影响：超声30 min，1次；超声30 min，2次；热回流3 h。各提取液按上述色谱条件测定含量，3种提取方法中以第二种方法提取效率最高，故本实验采用超声提取２×30 min方法制备样品。
3.1.4 方法学考察 分别精确吸取含量分析用混合对照品工作溶液20 μL，重复进样7次，以峰面积值为指标计算RSD（n=7），考察方法的精密度。按2.3.2方法平行制备5份供试液，在含量分析色谱条件下，测定3种成分含量，以峰面积值为指标计算RSD（n=5），考察方法的重现性。取上述供试液，分别间隔0、4、8、16、24和48 h进样分析，测定3种成分含量，以峰面积值为指标计算RSD（n=6），考察样品的稳定性。在已知各成分含量的待提取供试品中分别定量加入３种成分的混合对照储备液，考察方法的平均回收率（n=6）。重现性、稳定性及回收率结果见表2。
3.1.5 不同批号葛根芩连配方颗粒含量分析 按 2.3.2制备供试液，在上述色谱条件下，分别测定3个批号的葛根芩连配方颗粒中葛根素、黄芩苷和小檗碱的含量，结果见表3。
3.2 葛根芩连配方颗粒指纹图谱的建立
3.2.1 色谱条件优化 实验中采用含量分析时的流动相，考察了多种流动相梯度，结果发现线性梯度洗脱时间程序甲醇为26％～70%时，80 min 内样品所有组分洗脱完全，葛根芩连配方颗粒中4种药材各组分分离度、峰形都较理想。根据葛根芩连配方颗粒指纹三维图谱，在270 nm波长下，峰数目较多，各峰高低比例适宜，且基线平稳，故波长选为270 nm。
表2 方法学考察结果（略）
Table 2 Results of method evaluation
表3 葛根芩连汤配方颗粒样品含量测定结果
Table 3 Contents of constituents in Gegen Qinlian despensing granules
3.2.2 葛根芩连配方颗粒指纹图谱的建立 由于黄芩苷出峰时间居中，峰面积较大，故实验中以黄芩苷作为参照峰，采用指纹图谱相似度评价系统2004A（国家药典委员会）对11批葛根芩连配方颗粒进行相似度评价，共标定了32个共有峰，图2为11批样品指纹图谱( a)和共有模式指纹图谱( b)。实验结果表明，保留时间≤30 min的色谱峰中，单峰面积占总峰面积≥20％的只有9号峰、≥10％的有7、10、11、13号峰，≥5％的有17、18号峰；保留时间＞30 min的共有峰中，单峰面积占总峰面积≥20％的有22、28号峰、≥10％的有23号峰；11批样品指纹图谱相似度分别为0.999、0.997、0.999、0.998、0.999、0.999、0.998、0.996、0.999、0.997和0.999，均在0.9以上，非共有峰面积占总峰面积百分比为4.1%。
图2 葛根芩连配方颗粒11批样品指纹图谱和共有模式指纹图谱（略）
Fig.2 Original chromatographic fingerprints of 11 Gegen Qinlian Despensing Granules (a) and reference fingerprint (b)
3.2.3 方法学考察 按2.3.2制备5份平行样品，在指纹图谱色谱条件下，考察方法的重现性；取其中一份样品连续进样5次，考察方法的精密度；间隔0、4、8、16、24、48h 分析同一样品，考察样品的稳定性。以黄芩苷为参照峰，分别计算相对保留时间、相对峰面积和RSD。实验结果表明，在重现性、精密度和稳定性方法学考察中分别有21个、22个和20个峰相对峰面积RSD小于3.0%，32个峰相对保留时间RSD小于3.0%，符合指纹图谱要求。
3.3 小结
本研究采用二极管阵列检测器，反相高效液相梯度洗脱方式，对葛根芩连配方颗粒中不同结构类别的主要标志性成分葛根素、黄芩苷和小檗碱进行含量分析，同时建立了葛根芩连配方颗粒指纹图谱。研究表明，葛根芩连配方颗粒中四种药材葛根、黄芩、黄连和炙甘草的组分都得到很好的分离，指纹图谱具有较高的精密度、稳定性和重现性，11批葛根芩连配方颗粒的相似度均在0.9以上。本研究既考虑了葛根芩连配方颗粒主要指标性成分的含量，又考虑了其指纹图谱整体相似度，较全面地反映了中成药的整体质量。本实验所建立的质量分析方法简捷方便，为葛根芩连制剂的研究及质量控制提供了良好的基础，也为中成药的现代化提供了示范性研究。
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